Uffizi zostało zbudowane na polecenie Kosmy I z rodu Medyceuszy przez Giorgo Vasari. Prace rozpoczęto w 1560 r. i po 20 latach ukończono budowlę, w której początkowo miały się mieścić urzędy administracyjne i sądownicze. Z tym pierwotnym przeznaczeniem wiąże się nazwa obiektu - uffizo w języku włoskim oznacza "urząd".

W budynkach od strony wewnętrznego dziedzińca, na parterze zbudowano otwartą loggię, poziom I piętra zamykają okna a na II piętrze umieszczono galerię. Na parterze, w niektórych filarach wykonano nisze mieszczące posągi znanych osobistości Toskanii. W 1971 r. w zabudowaniach parteru odkryto pozostałości romańskiego kościoła San Pietro Scherraggio, w którym zachowały się freski Andrea del Castagno.

Na I piętrze znajduje się Gabinet Rysunków i Sztychów, jego kolekcję zapoczątkowały gromadzone w XVI wieku zbiory kardynała Leopolda Medyceusza.

Na II piętrze mieści się słynna galeria ulokowana w 45 salach. Zbiory zostały podarowane miastu w 1737 r. przez Annę Marię Ludwikę z Medyceuszów. Oprócz nich, w pomieszczeniach II piętra umieszczono także Archiwum Państwowe przechowujące cenne dokumenty związane z historią Florencji.

Wśród zbiorów Galerii Uffizi przeważają obrazy szkół włoskich i flamandzich. W salach eksponowane są dzieła wielu znanych malarzy. Oto niektórzy z nich:
- Cimabue, Giotto, Duccio - trzy ołtarze Ukoronowanie Marii,
- Simone Martini - Zwiastowanie,
- Piero della Francesca - portret Księcia Frederica da Montefeltro i Battisty Sforzy,
- Fra Filippo Lippi - Madonna z Dzieciątkiem i dwoma aniołami,
- Sandro Botticelli - Madonna, Narodziny Wenus, Wiosna (Primavera), Pokłon Trzech Króli
- Leonardo da Vinci Zwiastowanie, Chrzest, szkic Pokłon Trzech Króli (na obrazach tych są duże fragmenty namalowane ręką Leonardo, ale nie ma obrazu, którego byłby jedynym twórcą),
- Michał Anioł - Święta Rodzina,
- Rafael - Cudowna Madonna ze szczygłem, Papież Leon X z kardynałami Giulliem de'Medici i Luigim de'Rossi,
- Lucas Cranach,
- Hugo van der Goes - tryptyk Portinarich
- Albrecht Dürer - Pokłon Trzech Króli, Portret ojca,
- Giovanni Bellini - Święta Alegoria
- Tycjan - Flora, Rycerz maltański, Wenus z Urbino,
- Rubens - Portret Izabelli Brandt,
- Parmigiano - Madonna z długą szyją
- Van Dyck,
- Rembrandt,
- Caravaggio - Bachus.
Znajduje się tu także galeria autoportretów słynnych malarzy. Są tu podobizny Andrea del Sarto, Bronzino, Berniniego, Rembranta, Rubensa, Van Dycka, Hogartha, Delacroixa i wielu innych. W salach umieszczono także kolekcję starożytnych rzeźb. Wystawiane są również golebiny (m.in. 8 arrasów tkanych w Brukseli według kartonów narysowanych przez Lukasa de Herre).

Podczas zwiedzania galerii można zobaczyć wizerunki polskich władców i książąt. Wystawiane są obrazy z podobiznami Zygmunta I, Zygmunta III Wazy, Władysława IV, Jana III Sobieskiego, Augusta II i Stanisława Augusta Poniatowskiego. Wśród miniatur znajdują się portrety Henryka Walezego, Stefana Batorego, Teresy Lubomirskiej i Heleny Radziwiłł.